Il Museo fu istituito inizialmente come Pinacoteca negli anni Venti del Novecento ma, in realtà, la formazione della ricca collezione artistica, che può essere ricostruita anche da un punto di vista documentario,inizia molti secoli prima. Infatti, il governo cittadino fu sempre coinvolto nell’arricchimento delle collezioni artistiche, commissionando opere a prestigiosi artisti già dal XVI secolo, per ornare e rendere più importante il Palazzo Comunale. Il punto di partenza fu ovviamente offerto dalla Resurrezione di Piero della Francesca, emblema e simbolo della città, affrescato intorno al 1460 nella sala dei Conservatori del Palazzo della Residenza, opera definita dallo scrittore inglese Aldous Huxley “la più bella pittura del mondo”. Grazie a questo illustre precedente, l’apparato governativo innescò un primo e innovativo fenomeno di collezionismo aperto al pubblico. Già nella seconda metà del Cinquecento, al fine di rendere maggiormente esplicativo il carattere rappresentativo del Palazzo, il Comune chiamò a decorare la Cappella della Residenza i Bassano, famosi pittori veneti assai operosi a Sansepolcro, e acquisì opere di Raffaellino del Colle e Leonardo Cungi.

Nel corso del Seicento, in occasione di una visita di Leopoldo II, la primitiva raccolta fu incrementata grazie al trasferimento, dal vicino Palazzo Pretorio, delle famose incisioni di Cherubino Alberti. Dati questi illustri precedenti fu poi naturale inserire in queste stanze, nel 1846, il San Ludovico, staccato dalle pareti del Palazzo Pretorio. A seguito delle soppressioni leopoldine e napoleoniche degli ordini religiosi, fra la fine del 1700 e il primo decennio del 1800, la collezione del Museo si andò costituendo come una sperimentale e approssimativa galleria di opere d’arte. La crescente volontà di conservare e tutelare il patrimonio artistico cittadino sostenne il trasferimento nelle sale del Palazzo della Residenza di opere che correvano “il pericolo di deperimento”; ci si riferiva in particolar modo ai dipinti conservati nella chiesa di Santa Chiara, di Sant’Agostino e al polittico della Madonna della Misericordia entrata far parte della Pinacoteca Civica nel 1901. Nel nuovo secolo a Sansepolcro si diffuse una vera e propria cultura della conservazione tant’è che oramai l’organizzazione della Pinacoteca coinvolgeva anche esperti che, di pari passo con la fortuna letteraria di Piero (Roberto Longhi, Mario Salmi, Kenneth Clark e Rudolf Wittkower), dimostravano un crescente interesse per la Valtiberina. Negli anni l’entusiasmo generale fu avvalorato dalla scoperta, e dal successivo trasferimento nelle sale del Museo, del San Giuliano. Successivamente la collaborazione tra il Comune di Sansepolcro, la Soprintendenza di Arezzo e la Regione Toscana permise di inaugurare, nel 1975, il nuovo Museo che risultava ampliato nei suoi spazi espositivi grazie al recupero di ambienti all’ultimo piano e al piano sotterraneo.